Microscópio

INTRODUÇÃO:

O nome microscópio (mikrós, pequeno, e skoppéoo, observar, ver através de) se deve a Jean Faber, membro da antiga Academia dos Lincei (1624)). Este termo designa um microscópio composto por uma objetiva e uma ocular, embora na prática tenha sido estendido a todos os instrumentos ampliadores simples e compostos.

O microscópio é um instrumento que permite observar os objetos não perceptíveis à vista desarmada. Isso se consegue mediante um sistema óptico composto por lentes de cristal que atravessadas pela imagem do objeto ampliam-na. Segundo o número e a posição das lentes, distinguem-se o microscópio simples (lupa = microscópio estereoscópio) e o microscópio composto.

Denominamos microscópio simples a toda e qualquer lente que com ou sem montagem própria, grande ou pequena, biconvexa ou planoconvexa, amplia os objetos. É comumente chamado de lupa. Existem numerosos modelos e variedades.

Podemos dizer que qualquer lente convergente utilizada de maneira que produza uma imagem virtual, e portanto, direta, e maior que o objeto é um microscópio simples. As lupas somente se diferenciam na montagem. Seu manejo é muito simples, e consiste praticamente em orientar a lente de modo que sua face plana ou menos curva fique voltada para o objeto e colocá-la a uma distância tal que este ( o objeto ) fique situado entre o foco e o vértice e tanto mais próximo daquela quanto maior se queira a imagem.

O microscópio composto é constituído pela combinação de dois sistemas de lentes

convergentes: um próximo do olho do observador, motivo pelo qual é chamado sistema de oculares, e que age como microscópio simples; outro, próximo do objeto denominado sistema de objetivas. Este é o verdadeiro microscópio, que estamos acostumados a ver em todos os laboratórios.

Com os modelos simples é possível obter bons aumentos e realizar excelentes observações pois, salvo para estudos muito especializados, que requerem grandes aumentos, um microscópio comum nos será suficiente para passar horas muito agradáveis e nos permitirá observar qualquer classe de materiais. Salientemos que, por muitas e variadas que sejam suas lentes, qualquer que seja sua potência, o princípio é sempre o mesmo: é suficiente colocar a objetiva de modo que o objeto fique colocado um pouco além do foco principal da lente, mas o mais próximo possível dele, para que a imagem formada seja real e a maior possível ( imagem intermediária).

Dispondo a ocular de maneira que a imagem real obtida pela objetiva fique situada entre o vértice e o foco da ocular, obter-se-á uma imagem virtual direta e maior do que a primeira. Observar-se-á pois, uma imagem do objeto virtual invertida e sumamente aumentada.

Quanto maiores forem as curvaturas das lentes e a distâncias entre o sistema de objetivas e o sistema de oculares maior será o aumento total.

Vimos, por conseguinte, que o microscópio composto possui dois sistemas de ampliação, o de oculares e o de objetivas. Para calcular o aumento total de um microscópio teremos, pois, que multiplicar o aumento próprio da objetiva pelo aumento da ocular.

Ocular: é uma lupa. As mais simples possui no seu interior duas lentes e um diafragma. No interior da ocular temos então: lente de campo, diafragma e a ocular propriamente dita.

Objetivas: são formadas internamente por várias lentes. As resoluções alcançadas e a maior parte da qualidade da imagem final dependem das lentes objetivas.

Há vários tipos de objetivas, que se diferenciam pela qualidade da imagem, correção de aberração e preço.

• Tipos de objetivas:

1. Acromáticas – são a mais simples. São aquelas sem nenhuma sofisticação, que os microscópios comuns possuem.

2. Semi-apocromática – são também chamadas de fluorita, porque este material entra na sua constituição, dando alguma correção para as aberrações.

3. Apocromáticas – possuem correção ampla. Abrangem todo o espectro.

4. Planapocromática – possui imersão, com aumento de 63 X e abertura numérica de 1,4. Com ela se consegue o máximo de resolução de um microscópio óptico.

Objetivas de imersão: são objetivas de maior aumento um que se utiliza óleo de imersão para aproveitar toda a abertura numérica da lente. O óleo possui índice de refração tal que impede que os raios luminosos sofram reflexão ao passar do material para o ar contido entre a lamínula e a objetiva.

Condensador: é formado por várias lentes internas. Tem por finalidade concentrar a de modo que a objetiva receba um cone cheio de luz. É regulado pelo diafragma de abertura.

Iluminação do Microscópio óptico

A iluminação é por Transparência, sendo o objeto observado fino suficiente para a luz o atravessar. Uma lâmpada ou espelho trazem a luz da parte inferior do microscópio e esta atravessa o condensador, o material a ser observado e depois a objetiva. Há microscópios que a luz provém do mesmo lado da objetiva. Chama-se epi-iluminação.

A luz usada: pode ser natural mas a mais comum é a de uma lâmpada com filamento de tungstênio. Emite luz quase branca (levemente amarelada).

Para obter o máximo de resolução do microscópio basta seguir a técnica de iluminação de Kohler. Como proceder?

1. Fechar o diafragma de abertura e focalizá-lo, mexendo no condensador. Aparecerá uma imagem facetada.

2. Centralizar a imagem acima.

3. Abrir o diafragma de abertura até iluminar uniformemente o campo.

Modalidades de observação em microscópios ópticos

1. Campo claro

2. Campo escuro

3. Contraste de fase

4. Contraste interferencial

5. Polarização

6. Fluorescência

7. Microscópio invertido

8. Microscópio estereoscópico

9. Confocal a laser

1. Campo claro: todo os microscópios funcionam com campo claro. É utilizado para observação de materiais corados, geralmente entre lâmina e lamínula.

2. Campo escuro: são microscópios que utilizam condensadores especiais. A luz fica de tal modo inclinada, que não penetra diretamente na objetiva. A luz atinge o material e somente a porção desviada pelo objeto penetra na objetiva, formando a imagem. O fundo fica claro e o material brilhante. Se não houver objeto o campo fica totalmente escuro. Esta modalidade da microscopia é utilizada para material de tamanho muito pequeno que sejam muito transparentes e apresentam pouco contraste para serem observados em campo claro.

3. Contraste de fase: baseia-se nos princípios físicos da difração da luz. Este microscópio é dotado de um sistema óptico especial que transforma diferenças de fase dos raios luminosos em diferenças de intensidade. Assim, as diferenças de fase, para as quais o olho não é sensível, tornam-se visíveis, pois são traduzidas em diferenças de intensidade luminosa, facilmente perceptível. O microscópio de contraste de fase pode ser usado de modo que as estruturas celulares apareçam escuras (fase positiva) ou claras (fase negativa).

4. Contraste interferencial: é muito útil quando se trabalha com materiais excessivamente espessos para contraste de fase ou quando se deseja visualizar pequenos detalhes de células sem corar, cujo halo de contraste de fase esteja provocando alterações na imagem.

5. Polarização: é utilizado na observação de materiais que sejam birrefringentes (estruturas anisotrópicas, com índices diferentes de refração como músculo, ossos, celulose, fibras, cabelos, cristais, etc.). O microscópio de polarização possui dois prismas: um polarizador e outro analisador. A luz ao penetrar em estruturas como as citadas se desdobra em duas. O prisma deixa passar uma das vibrações luminosas mas não a outra, de modo que as estruturas que forem isotrópicas serão canceladas e no seu lugar ficará escuro. As estruturas birrefringentes (anisotrópicas) produzirão um tipo de vibração luminosa que passará, ficando brilhante. Somente as estruturas birrefringentes aparecerão brilhantes, ficando o restante do material escuro.

6. Fluorescência: este microscópio é semelhante com o convencional, exceto por apresentar um sistema diferente de iluminação e jogos de filtro – um que filtra a luz antes da mesma alcançar o material e outro que filtra a luz emitida pelo mesmo. O espécime a ser estudado deve ser previamente marcado com algum composto fluorescente. Somente a luz emitida pelo objeto é observada, ficando desse modo brilhante com fundo negro. O microscópio óptico de fluorescência trabalha com sistema epi-iluminação.

7. Microscópio invertido: permite a observação de material muito espesso, impossível de visualizar nos demais microscópios. Permite que observe células dentro dos tubos e garrafas, sem contudo, precisar abri-las evitando-se assim problemas de contaminação.

8. Microscópio estereoscópico: possuem as oculares (lupa) que ampliam o material permitindo observações de espécimens para dissecções.

9. Confocal laser: possui uma série de peculiaridades que prime observar material espesso, sem corar, vivo ou não, pois focaliza diferentes planos focais, obtendo-se cortes ópticos. Ele trabalha, geralmente, com o mesmo tipo de sistema óptico usado pela florescência convencional, com a diferença que neste, todo o campo fica iluminado enquanto que no LSM, o sistema óptico focaliza somente um ponto em determinada profundidade no espécimen. Uma fonte luminosa bastante forte e brilhante é requerida e desse modo usa-se o laser. A luz do laser passa por um pequeno orifício e ilumina um único ponto do espécimen. A fluorescência emitida pelo material é coletada e conduzida para um detector, que possui um segundo orifício pequeno. Dessa forma a imagem final que teremos é aquela captada pelo segundo orifício.

Limite da resolução X Número de abertura

O limite de resolução corresponde à menor distância entre dois pontos em que eles ainda podem ser distinguidos separadamente. Desse modo, O poder de resolução do microscópio corresponde aos menores limites de resolução possíveis. Assim,

d = K x *
N.A.

Onde K é uma constante (0,61), * é o comprimento de onda utilizado e N.A. é o número de abertura da lente objetiva. Desse modo, ao utilizarmos um microscópio devemos logo reparar o número de abertura de suas objetivas, pois o melhor microscópio é aquele que vai apresentar o maior número de abertura pois seu limite de resolução será menor.

Poder de resolução

O poder de resolução é inversamente proporcional ao limite de resolução. O melhor microscópio é aquele com maior poder de resolução.

O limite de resolução do olho humano é em torno de 0,2 mm. O melhor microscópio óptico possui limite de resolução de 0,2 mm. Logo quanto menor o comprimento de onda melhor a resolução.

MICROSCOPIA ELETRÔNICA

A relação entre o limite de resolução e o comprimento de onda de uma radiação luminosa é verdadeiro para qualquer forma de radiação , seja ela um feixe de luz ou de elétrons. Com elétrons entretanto , o limite de resolução pode ser muito pequeno. O comprimento de onda de um elétron diminui com o aumento da sua velocidade. Em um microscópio eletrónico , com uma voltagem de aceleração de 100.000 V , o comprimento de onda de um elétron é 0,004 nm .Teoricamente , a resolução de tal microscópio seria cerca de 0,002 nm , que é 10.000 vezes maior do que a do microscópio ótico.

Entretanto , devido ao fato das aberrações de uma lente de elétrons serem mais difíceis de se corrigir do que aquelas produzidas por uma lente de vidro, o poder de resolução da maioria dos mais modernos microscópios eletrônicos é, nas melhores condições, 0,1 nm. Ainda mais, problemas na preparação da amostra, contraste e danos causados pela radiação limitam, efetivamente, a resolução normal para materiais biológicos para 2 nm. Contudo, este valor é cerca de 100 vezes melhor do que a resolução do microscópio óptico .

MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO (TEM)

O microscópio eletrônico de transmissão é semelhante ao microscópio óptico, a pesar de muito maior e invertido. A fonte de iluminação é um filamento ou cátodo que emite elétrons do topo de uma coluna cilíndrica de cerca de 2 metros de altura. Sendo os elétrons espalhados através de colisão com as moléculas de ar, primeiramente o ar tem que ser bombeado para fora da coluna para criar vácuo. Os elétrons são então acelerados a partir do filamento por um ânodo e atravessam um pequeno orifício formando um feixe de elétrons que desce pela coluna. Bobinas magnéticas, colocadas ao longo da coluna, convergem o feixe de elétrons assim como as lentes de vidro convergem a luz em um microscópio óptico.

A amostra é colocada no vácuo, através de uma câmara de compressão, na trajetória do feixe de elétrons. Como para o microscópio óptico a amostra é usualmente corada, neste caso, com material denso ao elétron, como veremos na próxima seção. Alguns dos elétrons que atravessam a amostra são espalhados pelas estruturas coradas com material denso aos elétrons o restante é convergido para formar uma imagem de forma análoga ao processo de formação de uma imagem no microscópio óptico em uma placa fotográfica ou em uma tela fosforescente. Devido ao fato de os elétrons disperso se desviarem do feixe, as regiões densas da amostra são destacadas como áreas de fluxo reduzido de elétrons, as quais se mostram escuras.

COLORAÇÃO NEGATIVA

Permitem a visualização de macromoléculas com auto resolução. Apesar de macromoléculas isoladas, como DNA ou proteínas, de alta massa molecular, podem ser prontamente analisadas ao microscópio eletrônico, se elas forem sombreadas com metal para produzir contraste, detalhes mais minuciosos podem ser vistos utilizando-se coloração negativa. As moléculas, sustentadas por um filme delgado de carbono ( o qual é praticamente transparente aos elétrons ), são lavadas com uma solução concentrada de sal mais pesado com acetato de uranila.

Após amostra secar, uma camada muito fina do sal do metal cobre completamente o filme de carbono exceto no local onde esta localizada a amostra. Devido ao fato das macromoléculas permitirem a passagem dos elétrons, muito mais facilmente do que a coloração de metal pesado circundante, uma imagem oposta ou negativa da molécula criada. Coloração negativa é especialmente útil para observação de grandes agregados de macromoléculas, como no caso dos vírus ou dos ribossomos e para visualização da estrutura da sub unidade dos filamentos de proteína.

Sombreamento e coloração negativa são capazes de produzir uma visão de superfície de alto contraste de pequenos agrupamentos de macromoléculas, mas ambos são limitados em termos de resolução devido ao tamanho da menor partícula do metal utilizado, tanto no caso do sombreamento quanto na coloração empregada.

MICORCÓPIO ELETRÔNICO DE VARREDURA

FUNCIONAMENTO:

O SEM - Microscópio Eletrônico de Varredura - utiliza os elétrons que são emitidos da superfície de amostra. A amostra a ser examinada é fixada, desidratada e coberta com uma camada fina de metal pesado. A amostra é varrida por um feixe de elétrons. O trajeto do feixe de elétrons é, em seguida, modificado por um conjunto de bobinas refletoras que o fazem percorrer o espécimen ponto a ponto e ao longo de linhas paralelas (VARREDURA). Ao atingirem o espécimen, os elétrons causam diversos efeitos. Emitem elétrons secundários que são colhidos pelo coletor, passam por um sistema de amplificação e são transformados em pontos de mais ou menos luminosidade. As micrografias são obtidas por fotografia da imagem na tela.

UTILIZAÇÃO:

Obter imagens tridimensionais de superfícies.

MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE CRIOFRATURA

FUNCIONAMENTO:

As células são congeladas à temperatura do nitrogênio líquido (-196C) e depois fraturado com uma lâmina de bisturi. O corte do plano da fratura tenta mostrar o interior da membrana celular.

UTILIZAÇÃO:

Possibilita uma forma de visualização do lado interno das membranas celulares.

MICROSCOPIA CRIOELETRÔNICA

FUNCIONAMENTO:

Uma camada muito fina ( ~ 100 nm ) de uma amostra hidratada rapidamente congelada. Um prendedor de amostra e necessário para manter esta amostra hidratada a -160C no vácuo do microscópio, onde esta pode ser observada diretamente, sem fixação, coloração ou secagem.

UTILIZAÇÃO:

Visão de estruturas internas tridimensionais de vírus por exemplo.

CONCLUSÃO

Os conhecimentos sobre as células progridem à medida que as técnicas de investigação se aperfeiçoam. O aparecimento de um novo instrumento de trabalho, ou a aplicação mais engenhoso de um aparelho já existente, leva sempre a novas descobertas e à elucidações de algumas funções celulares.

Muitas técnicas de microscopia óptica estão disponíveis para a observação de células. Células que foram fixadas e coradas podem ser estudadas em um microscópio óptico convencional, enquanto anticorpos acoplados a corantes fluorescentes podem ser usados para localizar moléculas específicas nas células em um microscópio de fluorescência.

O microscópio confocal de varredura proporciona secções ópticas finas, e pode ser usado para reconstruir uma imagem tridimensional, células vivas podem ser observadas em contraste de fase, contraste de interferência diferencial, ou óptica de campo escuro. Todas as formas de microscopia óptica são facilitados por técnicas de processamento eletrônico de imagens, que ampliam e retiram a imagem.

O advento do microscópio eletrônico e seu emprego para estudos morfológicos e citoquímicos representam enorme impulso para o conhecimento das funções celulares, como na determinação da estrutura detalhada das membranas e organelas na célula. Imagens tridimensionais da superfície das células e tecidos podem ser obtidos por microscopia eletrônica de varredura, enquanto o interior da membrana e células podem ser visualizados por técnicas de criofraturas e criodecapação respectivamente.

A influência do microscópio eletrônico foi tão grande que levou a uma revisão completa nos conceitos morfológicos dos constituintes celulares. Atualmente, a forma e a estrutura das organelas são geralmente descritos conforme aparecem no microscópio eletrônico.

O emprego conjunto das técnicas modernas, incluindo a radioautografia, a cultura de células em meios nutritivos definidos, o emprego da microscopia de fluorescência, do microscópio eletrônico de varredura, das técnicas de criofratura e das técnicas bioquímicas, veio ampliar de tal maneira o estudo da célula. Que se tornou usual designar essa nova abordagem sob a Biologia Celular e Molecular através da microscopia.

LISTA DE ABREVIATURAS

Na seqüência de aparecimento:

DAC : Doença Arterial Coronária
ATC : Angioplastia Transluminal Percutânea
CENIC : Central Nacional de Intervenções cardiovasculares
INCOR - FMUSP: Instituto do Coração da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
NHLBI : National Heart, Lung and Blood Institute
UI : Unidade Coronariana
IAM : Infarto Agudo do Miocárdio
PGDF : Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas
CCV : Cirurgia cardiovascular
RM : Revascularização do Miocárdio
FE : Fração de Ejeção
VE : Ventrículo Esquerdo
IC : Insuficiência Cardíaca
HAS : Hipertensão Arterial Sistêmica
DM : Diabetes Mellitus
UCO : Unidade Coronariana
HEL : Hospital Evangélico de Londrina
CINE : Cineangiocoronarioventriculografia