Considerações sobre Clostridium absonum na gangrena gasosa, na dissolução de cálculos biliares, na produção de xilanase e nos plasmídeos

1. RESUMO

Clostridium absonum anaeróbio esporulado semelhante ao Clostridium perfringens em suas propriedades bioquímicas e culturais e em relação à produção de uma proteína (fosfolipase C- alpha toxina). Evidencia a presença deste microrganismo a partir de espécimes clínicas em casos de gangrena gasosa. Isolado do solo atribui a sua participação na contaminação de alimentos e consequentemente em possível intoxicação alimentar. No intestino humano, Clostridium absonum, dando origem ao ácido ursodesoxicólico (UDCA), define o interesse em terapêutica, sendo primordial para a dissolução de cálculos de colesterol, de tamanho pequeno. Importante o emprego do método fluorimétrico enzimático em amostras de urina e soro para controle, nos pacientes em tratamento com cirrose biliar primária. O aumento de ácido ursodesoxicólico (UDCA) através da administração experimental em suínos de bactérias vivas elucida o estudo de grande importância da atividade probiótica futura em humanos. A produção de xilanase por este microrganismo poderia contribuir na diminuição dos custos de produção, por exemplo, em rações animais na indústria de alimentos. O isolamento de plasmídeos aumenta a investigação na biologia molecular, e na engenharia genética, recentemente, com o estudo sobre a  coenzima  hidroxiesteróide desidrogenase de Clostridium absonum. O procedimento bibliográfico mostra o interesse nas pesquisas sobre Clostridium absonum descrito por Nakamura, no Japão, em 1973, e isolado por Sousa em 1976 no Brasil. Os resumos das publicações científicas até então enumeradas têm sido motivo de grande diversidade em suas aplicações científicas presentes e futuras.

Palavras-chave: Alpha Toxina-Absonum-Clostridium

ABSTRACT

Clostridium absonum anaerobic sporulated is similar to Clostridium perfringens in their biochemical and cultural properties and the production of a protein (phospholipase C- alpha toxin). It shows the presence of this microorganism from clinical specimens in cases of gas gangrene. Isolated from the soil attaches its participation on food contamination and consequently in possible food poisoning. In the human gut. Clostridium absonum giving rise to ursodeoxycholic acid (UDCA) defines the interest in therapy, being essential for dissolving cholesterol gallstones, of small size. It is important the use of enzymatic fluorimetry method in urine and serum samples to be controlled, in patients under treatment with primary biliary cirrhosis. The increase of ursodeoxycholic acid (UDCA) through experimental administration in pigs of live bacteria elucidates the study of great importance of the future probiotic activity in humans. The production of xylanase by this microorganism could contribute to the lower production costs, for example in animal feed in the food industry. Isolation of plasmids enhances research in molecular biology, and in genetic engineering recently, with the study on hydroxysteroid coenzyme dehydrogenase from Clostridium absonum. The bibliographic procedure shows interest in the research on Clostridium absonum described by Nakamura in Japan, in 1973, and isolated by Sousa in 1976 in Brazil. The abstracts of scientific publications hitherto enumerated have been of great diversity in their present and future scientific applications.

Keywords: Alpha Toxin – Absonum – Clostridium

2. INTRODUÇÃO

Um estudo realizado no Japão resultou no reconhecimento de uma nova espécie no grupo dos clostrídios sacarolíticos, denominada de Clostridium absonum, bactéria anaeróbia esporulada, com características semelhantes ao Clostridium perfringens. Apresenta grande importância como o Clostridium perfringens em suas propriedades morfológicas, bioquímicas, culturais e genéticas?

Supõe-se que, por sua afinidade com Clostridium perfringens, durante anos, muitas identificações de Clostridium absonum foram feitas erroneamente pelas poucas informações encontradas na literatura. Destaque relevante, a participação do Clostridium absonum na gangrena gasosa, tratando-se de uma emergência médica. A produção de ácido ursodesoxicólico (UDCA) associado ao Clostridium absonum, que previne a formação de cálculos biliares de colesterol de tamanho pequeno. A administração dessa bactéria viva pode levar futuramente à investigação probiótica em humanos, relacionada aos cálculos.

Na indústria de alimentos, com redução nos custos de formulações e no aumento da digestibilidade, a produção de xilanase pelo Clostridium absonum seria objeto de estudo em sua utilização, já que é possível a obtenção pelo cultivo da bactéria em um meio definido. Por exemplo, em rações animais onde a enzima é muito empregada levando-se à melhora significativa nas dietas, permitindo alterações nas formulações das rações.

É provável, pela resistência dos esporos de Clostridium absonum ao aquecimento, que os alimentos poderiam estar contaminados com esse microrganismo, evidenciando-se sua participação quanto à intoxicação alimentar. Foi relatado o isolamento em alimentos do Clostridium absonum na literatura.

A intoxicação alimentar pode ser desencadeada por uma enterotoxina produzida pelo Clostridium perfringens tipo A. Discussão de relevância seria analisar no futuro se o plasmídeo isolado de Clostridium absonum poderia carregar gene-enterotoxina, além de outras características importantes. Assim sendo, com o isolamento de plasmídeos pelos pesquisadores, é provável realizar pesquisas no campo da Biologia Molecular.

O estudo da coenzima 7α hidroxiesteróide desidrogenase demonstrou um grande avanço nas pesquisas sobre Clostridium absonum com as     publicações nos anos de 2012, 2014, 2016, 2017, 2018 e 2019.

Isolado de amostras de solo no Brasil, foi motivo de interesse em ampliar as pesquisas bibliográficas, descrevendo os resumos científicos encontrados.

O objetivo foi demonstrar o papel desse microrganismo na gangrena gasosa, verificar a sua participação na dissolução de cálculos biliares, analisar a aplicabilidade da enzima xilanase produzida pelo Clostridium absonum na indústria de alimentos e ressaltar a presença de plasmídeos isolados com pesquisas futuras na biologia molecular.

Clostridium absonum foi descrito no Japão por Nakamura et al., 1973, tendo sido caracterizado a partir de amostras não identificadas semelhantes ao Clostridium perfringens. Além da taxonomia numérica e análise computada Sneath, 1957 analisaram os componentes da parede celular: aminoácidos, açúcares, % conteúdo G+C e homologia de DNA-DNA Marmur, 1961 no sentido de fazer um estudo mais detalhado desse microrganismo, bem como uma melhor classificação.

Em relação à produção de lecitinase, Nakamura et al.,1973 verificaram que as amostras de Clostridium absonum exibiram títulos mais baixos do que as de Clostridium perfringens tipo A, porém a lecitinase de Clostridium absonum não poderia ser neutralizada, mesmo com uma excessiva concentração de antitoxina de Clostridium perfringens tipo A. As zonas de reação de lecitinase ao redor das colônias em agar Nagler foram do mesmo tamanho que aquelas produzidas pelo Clostridium perfringens tipo A.

Clostridium absonum produz uma toxina semelhante à alpha toxina de Clostridium perfringens tipo A. Lecitinase, hemolisina e toxina letal no filtrado da cultura dessa espécie exibiu baixa avidez pelas antitoxina de Clostridium perfringens tipo A. As 3 (três) atividades foram inseparáveis pelo método de purificação. A reinvestigação das propriedades bioquímicas revelou que a incompleta neutralização da reação de lecitinase pela antitoxina de Clostridium perfringens tipo A e não fermentação de rafinose, melibiose e amido foram critérios para diferenciar Clostridium absonum de Clostridium perfringens. (HAYASE et al., 1974).

A proteína (Fosfolipase C) de Clostridium absonum apresenta 60% de identidade na sequência de aminoácidos com fosfolipase C ou alpha toxina de Clostridium perfringens tipo A e tem sido isolada a partir de pacientes que sofrem de gangrena gasosa. É provável, que a enzima exerça um papel similar à alpha toxina de Clostridium perfringens tipo A na patogênese da doença. Diferenças existem entre a alpha toxina de Clostridium perfringens tipo A e de Clostridium absonum e seriam explicadas através da formação estrutural de modelos experimentais por cristalografia-difração de raio X. (NAYLOR et al., 1998) (CLARK et al., 2003).

No Japão e no Brasil o isolaram do solo, e nenhuma amostra de Clostridium absonum foi encontrada em fezes humanas Hayase et al.,1974, Sousa, 1976,1979, entretanto Nakamura et al.,1976; Brett,1994 relataram a presença em fezes humanas. Não levaram em consideração os caracteres variáveis de Clostridium perfringens já que este microrganismo, quando isolado em condições de aquecimento, poderia ser confundido com Clostridium absonum. (NISHIDA et al., 1969) (NAKAMURA & NISHIDA, 1974).

Através das provas de fermentação de lactose (+), salicina (+), rafinose (-) hidrólise do amido (-) e lecitinase pobremente neutralizada pela antitoxina de Clostridium perfringens tipo A poderia identificar Clostridium absonum. (HAYASE et al., 1974) (SOUSA, 1976, 1979).

A produção de hemaglutinina pelo Clostridium perfringens variou em função da temperatura usada para o seu isolamento. As estudadas produtoras de hemaglutinina foram isoladas sem aquecimento enquanto as termorresistentes foram destituídas dessa propriedade. Clostridium absonum foi incapaz de hemaglutinar, não sendo possível se estabelecer uma diferença segura entre Clostridium absonum e Clostridium perfringens à base exclusiva da produção de hemaglutinina. (SOUSA et al., 1984).

Cepas de Clostridium perfringens não foram citotóxicas quanto à produção de citotoxinas, utilizando-se fibroblastos de pulmão embrionário humano em cultura de tecidos como células indicadoras, apesar da sua patogenicidade para cobaias. Clostridium absonum não apresentou produção de citotoxina.  (SCHALLEHN & WOLFF, 1988).

Em trabalho recente, Wang et al., 2005  se referem ao Clostridium sardiniense, Prévot, 1938 e Clostridium absonum Nakamura et al.,1973 considerados semelhantes em  suas propriedades biológicas e bioquímicas, mas sua posição taxonômica não foi clara pela  hibridização de DNA-DNA. O estudo relatou que Clostridium absonum formou alta identidade com Clostridium sardiniense, implicando que Clostridium absonum e Clostridium sardiniense são sinônimos heterotípicos. Clostridium sardiniense foi isolado de fezes de crianças Borriello, 1980, e com frequência no solo Rodriguez et al., 1993 não existindo nenhuma associação em casos de gangrena gasosa.

A classificação atual desse microrganismo é mencionada como: Phylum Firmicutes  Class Clostridia / Order Clostridiales / Family Clostridiaceae / Genus Clostridium. (BERGEYS MANUAL, 2009).

O avanço nas pesquisas encontradas na literatura sobre enterotoxina de Clostridium perfringens tipo A refere-se à sua cristalização através da cristalografia-método difração de raio X (  BRIGGS  et al., 2010).

As publicações sobre a coenzima 7α- hidroxiesteróide desidrogenase de Clostridium absonum revelaram a continuidade nos estudos e avanço nas pesquisas com esse microrganismo (FERRANDII et al., 2012) (DESHUAI et al., 2014), (2016), (2017), (2018) (HUANG et al., 2019).

Existe um apreciável acervo de informações, onde serão citadas dando relevante destaque em algumas considerações como na gangrena gasosa, Titball, 2005, em cálculos biliares Lepercq et al., 2005, na produção de xilanase Rani & Nand, 2000 e no isolamento de plasmídeos Roberts et al., 1986,com resumos de diversas publicações.

Por se tratar de revisão bibliográfica com abordagem qualitativa, foi dada ênfase às pesquisas na literatura mais relevantes dos autores sobre Clostridium absonum. Estas citações serão enumeradas e discutidas no decorrer do trabalho e mostrada a forma como foram realizadas, apresentadas e os resultados encontrados.

Nos procedimentos metodológicos, o tipo de pesquisa utilizada foi a descritiva, com a tecnologia avançada para coleta de informação do uso do computador, via internet. É possível, o acesso remoto e rápido a informações em qualquer parte do planeta. A interligação ocorre com a disponibilização de dados e informações.

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3. Gangrena gasosa

As bactérias estão presentes em maior número no solo em quantidade e em variedade, sendo, na maioria, heterotróficas e na forma de bacilos esporulados Genus Bacillus e Clostridium.

A contaminação com o solo pode resultar no grave problema da gangrena gasosa denominada de mionecrose clostrídica, principalmente pelo Clostridium perfringens tipo A e várias outras espécies de clostrídios. Quando não for tratada pode levar à morte devido à queda de pressão (choque), coma, insuficiência renal.

Clostridium perfringens tipo A é um bastonete gram positivo, esporulado, que em condições de anaerobiose produz exotoxinas e gás causando necrose do tecido e sintomas associados. Geralmente ocorre pela contaminação em locais traumatizados ou em ferida cirúrgica recente, iniciando-se repentinamente e de caráter grave. A amputação muitas vezes faz-se necessária, evitando a evolução da doença. O tratamento é feito através do desbridamento cirúrgico com remoção de tecido morto ou infectado, antibióticos (altas doses, geralmente penicilina e clindamicina) ou pela medicina hiperbárica- oxigenoterapia. (GOLDMAN & SCHAFER, 2011).

Na comunidade civil, os idosos, diabéticos e vítimas de acidentes são todos especialmente suscetíveis. É difícil obter uma estimativa, sendo provável que a incidência da gangrena gasosa vá aumentar no futuro pela expectativa maior de vida. Nos conflitos armados, como consequência, as lesões traumáticas são constantes. Os inúmeros episódios sangrentos de combate não param de acontecer em diversos pontos do planeta atualmente com o terrorismo e a violência urbana. E assim, a situação torna-se preocupante em relação a este patógeno e suas toxinas. O uso de microrganismos e seus produtos vem sendo por sua vez utilizado como armas biológicas letais nos confrontos implicados pelos homens ao longo do tempo, o que pode resultar fatalmente na destruição em massa das vítimas. (TITBALL, 2005).

De relevância Clostridium absonum, semelhante em suas características ao Clostridium perfringens, foi isolado de pacientes com gangrena gasosa e alguns achados clínicos serão apresentados:

Caso 1- Amostra semelhante ao Clostridium perfringens foi isolada de um caso de gangrena gasosa. As propriedades morfológicas e a reação de lecitinase foram muito similares a de Clostridium perfringens. Entretanto, a reação de lecitinase foi somente ligeiramente neutralizada pelas alpha-antitoxina de Clostridium perfringens tipo A e o organismo identificado como Clostridium absonum em suas propriedades bioquímicas. (MASAKI et al.,1988).

Caso 2- Uma jovem caiu de uma corda durante a prática de atletismo de campo e sofreu uma fratura exposta no antebraço direito (radio e ulna). Os achados clínicos indicaram lesão característica de gangrena gasosa, com produção de gás, secreção escura e odor fétido, sendo realizado o procedimento de desbridamento cirúrgico em um hospital local. No exame microbiano a partir da secreção, foram encontrados bacilos coliformes em cultura aeróbica. As placas de agar sangue 10%, incubadas anaerobicamente, predominaram colônias de bastonetes gram positivos, poucas colônias de cocos gram positivos e bastonetes gram negativos facultativos. As placas foram semeadas de uma cultura de 24 h do material colhido da secreção no meio TGC (Nissan Co, Tokyo). Os bastonetes gram positivos foram identificados como Clostridium sporogenes e Clostridium bifermentans de acordo com Bergey`s Manual of Determinative Bacteriology (8^th ed). Organismos semelhantes ao Clostridium perfringens não foram isolados. Embora a terapia de alta potência de oxigênio-HOP (Oxigenoterapia) e antibióticos fossem administrados ao paciente, o inchaço avermelhado no braço continuou. Posteriormente, realizou-se uma incisão adicional e foi colhido material encontrado na medula óssea da parte proximal da ulna fraturada. Os sintomas melhoraram rapidamente e a oxigenoterapia foi suspensa. O paciente não havia recebido terapia com alpha-antitoxina Clostridium perfringens tipo A. Da secreção coletada, então, no meio TGC, foi obtida cultura pura de organismo semelhante ao Clostridium perfringens. Propriedades culturais de colônias em agar sangue 1% glicose, reação de lecitinase em agar gema de ovo (agar Nagler) e microscopia foram semelhantes ao Clostridium perfringens. A reação de lecitinase em agar Nagler (metade da placa espalhada com uma gota de alpha-antitoxina Clostridium perfringens tipo A - 625 units/ml) foi ligeiramente neutralizada.

As propriedades bioquímicas diferenciais mostraram que o organismo identificado seria Clostridium absonum. Embora indicasse que a lesão tinha característica de gangrena gasosa, a doença desenvolveu em ritmo extremamente lento. Acreditamos que o bom prognóstico foi relatado da fraca patogenicidade deste microrganismo. (NAKAMURA et al., 1979).

Caso 3- Duas (2) amostras de Clostridium absonum isoladas de espécimes clinicas e uma (1) amostra-tipo (BP6K) foram analisadas quanto à resistência de esporos, propriedades bioquímicas e neutralização da lecitinase pelas alpha- antitoxina Clostridium perfringens tipo A. Métodos RapID ANA (AMUCO) e ANIDENT (API) kits para identificação de Clostridium absonum foram testados. Os resultados mostraram que os isolados foram resistentes ao aquecimento 70 graus C /10 min e a amostra-tipo ao aquecimento 85 graus C/10min, portanto, menos resistente que Clostridium perfringens BP6K. Clostridium absonum diferenciou-se de Clostridium perfringens na fermentação de trealose, melibiose e rafinose e hidrólise de esculina e amido. A lecitinase de Clostridium absonum não foi completamente neutralizada pelas alpha-antitoxina Clostridium perfringens tipo A e ambos RapID ANA e ANIDENT kits foram úteis para diferenciar Clostridium absonum de Clostridium perfringens, mas não para identificação de Clostridium absonum. (MASAKI et al., 1992).

Como foi demonstrado e discutido (modelo experimental - difração de raio-X em 3D) em publicação sobre alpha toxina de Clostridium absonum as propriedades da fosfolipase C (alpha toxina) seriam compatíveis no seu papel como um determinante de virulência na gangrena gasosa causada por esse microrganismo anaeróbio com características semelhantes ao Clostridium perfringens. (CLARK et al., 2003).

4. Cálculos biliares

Cálculos biliares são depósitos sólidos como cristais que se formam dentro da vesícula biliar. Variam de tamanho e podem ser eliminados, quando necessários, a critério médico por medicamentos ou cirurgia.

Foi investigada a composição química dos cálculos da vesícula biliar em pacientes colecistectomizados no Hospital Universitário (HU) da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). Os cálculos de 117 (cento e dezessete) pacientes naturais e procedentes do estado de Santa Catarina operados consecutivamente em 2015 no HU-UFSC foram analisados por método bioquímico para determinação da sua composição. A análise dos dados revelou que os cálculos de colesterol foram predominantes seguidos dos do tipo misto e por último dos pigmentados. Este estudo confirma a maior prevalência de cálculos de colesterol em uma população de modo geral. (TEIVE et al., 2018).

Em terapêutica, o ácido ursodesoxicólico (UDCA) é o medicamento de escolha para o tratamento da cirrose biliar primária e a dissolução dos cálculos biliares de colesterol. Foi realizado um estudo sobre a biodisponibilidade de 4 (quatro) formulações de ácido ursodesoxicólico (UDCA) comercialmente disponíveis em doses (via oral) padronizadas no Canadá e EUA. (WILLIAMS, AL-KNAWY & BLANCHARD, 2000).

Quando a medicação é administrada intravenosamente, sua biodisponibilidade é de 100%. Entretanto, a medicação sendo administrada por outras vias como a via oral, por exemplo, sua biodisponibilidade diminui devido à absorção incompleta e ao metabolismo de primeira passagem. (SHARGEL&YU, 1999).

O ácido ursodesoxicólico (UDCA) pode chegar a dissolver cálculos biliares de colesterol de tamanho pequeno com diâmetro máximo de 1,5cm. É indicado para o uso humano e veterinário (cães e gatos) por via oral, com a denominação genérica de ácido ursodesoxicólico (UDCA). Mecanismo de ação: ácido ursodesoxicólico (UDCA) sendo um ácido biliar fisiologicamente presente na bile humana, embora em quantidade limitada inibe a síntese hepática do colesterol e estimula a síntese de ácidos biliares restabelecendo desta forma o equilíbrio entre eles. O ácido ursodesoxicólico (UDCA) aumenta a capacidade da bile em solubilizar o colesterol, transformando a bile litogênica em uma bile não litogênica (que solubiliza o colesterol), prevenindo a formação e favorecendo a dissolução gradativa dos cálculos. A dissolução dos cálculos já formados processa-se através da passagem do colesterol do estado cristalino sólido ao de cristais líquidos. Além disso, o ácido ursodesoxicólico (UDCA) substitui os ácidos biliares hidrofóbicos (tóxicos) por ácidos biliares hidrofílicos (menos tóxicos) nos processos colestáticos. (MINISTÉRIO DA SAÚDE. Portaria SAS/MS n° 224, de 10 de maio de 2010. (Retificada em 27.08.10). Protocolo Clínico e Diretrizes Terapêuticas Fibrose Cística-Insuficiência Pancreatica. Disponível em: http://portalsaude.saude.gov.br/dicas-de-saude/404.html - último acesso: 31/05/2019.)

Citação de algumas publicações sobre a importância do ácido ursodesoxicólico (UDCA) relacionada ao Clostridium absonum na dissolução de cálculos biliares.

-Clostridium absonum ou uma espécie bioquimicamente semelhante pode estar presente no intestino humano dando origem ao ácido ursocólico (UCA) e ácido ursodesoxicólico (UDCA), in vivo, a partir de ácidos biliares primários. (MACDONALD et al., 1981).

- 7β hidroxiesteróide desidrogenase (HSDH) foi parcialmente purificada por cromatografia de afinidade, a partir de culturas de Clostridium. absonum induzidas por ácido quenodesoxicólico (CDCA). Evidentemente, Clostridium absonum sintetiza 7α e 7β-HSDH e uma série de outras proteínas em resposta aos ácidos biliares que podem, na ausência das desidrogenases, ser tóxicos. A HSDH catalisa a epimerização (uma reação onde se cria epímeros) de CDCA ao UDCA que é menos tóxico. (MACDONALD   et al., 1983).White, BA.

-Conversão do ácido quenodesoxicólico (CDCA) em ácido ursodesoxicólico (UDCA) pelo Clostridium absonum em cultura e em células imobilizadas. A bioconversão do ácido quenodesoxicólico (CDCA) ao ácido ursodesoxicólico (UDCA) foi observada em culturas de Clostridium absonum. Utilizando o ácido carboxil- [14C] quenodesoxicólico, puderam medir a conversão de aprox. 80% of the CDCA to UDCA. 80% do CDCA para o UDCA. A transformação de CDCA em UDCA em células imobilizadas foi aumentada quando as células foram mantidas sob condições anaeróbicas. (KOLE & ALTOSAAR, 1985).

-Mecanismos envolvidos na epimerização de ácido quenodesoxicólico (CDCA) e ácido ursodesoxicólico (UDCA) do Clostridium absonum, empregando as técnicas de marcação isotópica do átomo de hidrogênio na posição alpha ou beta carbono- 7 desses ácidos biliares. (MACONI et al., 1988).

- Foi desenvolvido um método enzimático fluorimétrico para a determinação do ácido ursodesoxicólico (UDCA) e seus conjugados glicina e taurina na urina. A 7β-HSDH (7β-hidroxiesteróide desidrogenase) que ainda não está comercialmente disponível, foi isolada a partir de culturas de Clostridium absonum (ATCC N^o. 27555) e purificada por cromatografia de afinidade. O método foi aplicado com sucesso para determinação de UDCA em amostras de urina de pacientes submetidos à terapia com UDCA. Foram colhidas aleatoriamente de pacientes, controles foram usados e os resultados foram expressos como relação de [UDCA] / [creatinina] para corrigir a variação no fluxo de urina. (LIANIDOU, PAPASTATHOPOULOS & SISKOS, 1989).

-O método enzimático fluorimétrico foi modificado para a determinação do ácido ursodesoxicólico (UDCA) e seus conjugados glicina e taurina no soro humano. Um procedimento simples e rápido de purificação e pré-concentração foi empregado para a extração de UDCA a partir de soro humano. A 7 β-HSDH, foi isolada a partir de culturas de Clostridium absonum (ATCC N^o. 27555) e purificada por cromatografia de afinidade. A recuperação do UDCA a partir de amostras de soro foi de cerca de 99% (intervalo de 85-105%). O método foi aplicado com sucesso na determinação de UDCA em amostras de soro de pacientes tratados com UDCA para cirrose biliar primária. (LIANIDOU, PAPASTATHOPOULOS & SISKOS, 1989).

-Alguns parâmetros de fermentação foram determinados para Clostridium absonum em um quimiostato usando um meio quimicamente definido com glicose como única fonte de carbono e energia. O quenodesoxicolato induziu as desidrogenases 7α- e 7β -hidroxiesteróides de Clostridium absonum. Na presença do quenodesoxicolato, Clostridium. absonum favoreceria a produção de energia de modo a garantir o seu crescimento, e a epimerização do quenodesoxicolato ao ursodesoxicolato. (WARCHOL et al., 2003).

-O aumento de ácido ursodesoxicólico (UDCA) na circulação entero-hepática de suínos através da administração de bactérias vivas de Clostridium absonum, foi capaz de epimerizar o ácido quenodesoxicólico (CDCA) endógeno para ácido ursodesoxicólico (UDCA). O experimento demonstrou que a combinação de Bifidobacterium animalis DN-173 010, como uma bactéria hidrolisadora de sais biliares e Clostridium absonum ATCC 27555, como um CDCA para bactéria epimerizante de UDCA, levou à epimerização eficiente de glico e tauro-CDCA in vitro. Em conclusão, é possível aumentar a biodisponibilidade do UDCA para o intestino e o fígado pela administração de bactérias ativas. Isto pode representar uma nova e interessante atividade probiótica, desde que no futuro possa ser expressa por um microrganismo alimentar seguro. (LEPERCQ et al., 2005).

Na literatura há relato sobre o uso terapêutico na dissolução de cálculos biliares de colesterol com ácido quenodesoxicólico (CDCA) e ursodesoxicólico (UDCA). Neste estudo comparativo, pacientes com microcálculos e vesícula permeável tiveram os cálculos dissolvidos. Foi ministrada a droga a 40 (quarenta) doentes sendo que, só 14 (quatorze) terminaram o protocolo que previa a administração de ácido quenodesoxicólico (CDCA) na dose de 15 mg/kg e/ou o ácido ursodesoxicólico (UDCA) na dose de 10 mg/kg por um ano. 6 (seis) desses, com microcálculos e vesícula permeável, tiveram seus cálculos dissolvidos. Dos 4 (quatro) com colecistograma negativo, 2(dois) tiveram vesículas normais após 18 (dezoito) meses de tratamento, enquanto os outros 2 (dois) permaneceram assintomáticos, porém com vesículas excluídas. Em 3 (três) doentes com cálculos maiores que 0,5 cm, nenhum benefício se obteve, em relação à dissolução dos mesmos. Efeitos colaterais: dos 40 (quarenta) doentes, um, tratado com ácido quenodesoxicólico (CDCA), interrompeu o tratamento por diarreia e 2 (dois) outros por obstrução aguda do cístico, tendo um sido operado na fase aguda. Preconizamos a dose de manutenção nos que obtiveram a dissolução dos cálculos de 0,5 cm de ácido ursodesoxicólico (UDCA) 2(duas) vezes por semana, na expectativa de manter sua bile não litogênica. (VILELA, 1981).

No âmbito científico, foi descrito pelos autores que no intestino humano Clostridium absonum dá origem ao ácido ursodesoxicólico (UDCA). Define o interesse deste ácido em terapêutica em pacientes com cálculos biliares, primordial para a dissolução de cálculos de colesterol de tamanho pequeno. Pode ser obtido a partir de culturas do microrganismo pela conversão do ácido quenodesoxicólico (CDCA) para ácido ursodesoxicólico (UDCA). Clostridium absonum sintetiza 7α e 7β hidroxiesteróide desidrogenase -HSDH e uma série de outras proteínas em resposta aos ácidos biliares que podem, na ausência das desidrogenases, ser tóxico. A HSDH catalisa a epimerização do quenodeoxi-(CDC) ao ácido ursodesoxicólico(UDCA) que é menos tóxico. Vários estudos sobre esta coenzima estão sendo desenvolvidos mostrando o interesse dos pesquisadores com relação a HSDH do Clostridium absonum.

5. Alimentos

5.1. Intoxicação alimentar

A intoxicação alimentar é uma doença causada pela ingestão de alimentos que contém organismos prejudiciais como bactérias, parasitas e vírus. Pode ser desencadeada por uma enterotoxina produzida pelo Clostridium perfringens tipo A. A cristalização da enterotoxina foi obtida através da cristalografia-método difração de raio X. (BRIGGS et al., 2010).

A enterotoxina é formada no processo de esporulação pelo Clostridium perfringens tipo A e os esporos germinam durante o aquecimento do alimento, por se apresentarem termo resistentes. As bactérias crescem muito rapidamente entre 43°C /47°C. Se o alimento é servido sem reaquecimento, bactérias vivas podem estar presentes, produzindo então uma toxina no interior do intestino que causa a doença. A gastroenterite é normalmente ligeira, em que o paciente é hidratado, aconselhando-se repouso. Embora, possa desenvolver-se um quadro grave com dor abdominal, flatulência, diarreia intensa, desidratação e choque. Alimentos à base de frango e de carne bovina têm sido os principais causadores de intoxicação alimentar, sendo uma das causas mais comuns de doenças transmitidas por alimentos. A principal medida de controle para minimizar os problemas de infecção por Clostridium perfringens tipo A é baseada na prevenção da multiplicação da bactéria pela refrigeração adequada de alimentos preparados, ressaltando que abaixo de 15°C o crescimento já é bastante limitado. (FRANCO, 2008).

Foram isoladas amostras de Clostridium perfringens em carne moída bovina obtidas em açougues do Estado do Rio de Janeiro numa frequência de 57,1% sendo 21,4% de amostras termorresistentes (aquecidas 80 graus C / 10 min e 100 graus C / 60 min) e 7,1% de amostras enterotoxigênicas identificadas pela técnica de imunodifusão radial dupla a partir do sobrenadante no meio de Tortora. (SOUSA & TORTORA, 1986).

Um método do Número Mais Provável (NMP) envolvendo o meio Agar Differential Reinforced Clostridial seguido pela semeadura em meio Willis & Hobbs foi comparado com plaqueamento de amostras em Agar Tryptose-Sulphite-Cycloserine sem gema de ovo e em Agar Oleandomycin-Polymyxin-Sulphadiazine-Perfringens, a partir de amostras de pele retiradas de carcaças de frango em diferentes estágios de processamento. Os 3 (três) meios deram contagens semelhantes de Clostridium perfringens enquanto os resultados obtidos com o método de NMP foram consistentemente baixos. Embora a contagem de Clostridium perfringens dos vários produtos processados fossem usualmente menos que 10/g, os 3 (três) meios mostraram similar especificidade para o organismo. Todos os meios deram bom crescimento em amostra-tipo de Clostridium perfringens, mas foram encontradas espécies fisiologicamente semelhantes, incluindo Clostridium absonum, Clostridium paraperfringens e Clostridium perene que também cresceram bem nestes meios e produziram colônias idênticas a de Clostridium perfringens, indicando assim, a necessidade de testes confirmatórios ao examinar amostras naturais. (ADAMS & MEAD, 1980).

Provável, pela resistência dos esporos de Clostridium absonum ao aquecimento à 70 graus C discutido por Masaki et al.,1992, que os alimentos oriundos do solo Hayase et al.,1974 e Sousa, 1976, 1979 poderiam estar contaminados com esse microrganismo esporulado, evidenciando-se na sua provável importância quanto à intoxicação alimentar. O isolamento e a identificação do Clostridium absonum em alimentos foram mencionados na literatura, por ter características muito semelhantes ao Clostridium perfringens. (ADAMS & MEAD ,1980) (RHODEHAMEL&HARMON, 1998).

A presença de Clostridium absonum em fezes humana foi evidenciada por Nakamura et al.,1976. Sendo uma causa comum à intoxicação alimentar pelo Clostridium perfringens tipo A, a produção de lecitinase (alpha toxina) é frequentemente usada para identificar o organismo. Encontradas amostras de . Clostridium perfringens com atividade lecitinase negativa, classificadas como variantes por Nakamura et al., 1976. Dez (10) surtos de intoxicação alimentar causados por Clostridium perfringens lecitinase negativa foram informados. (BRETT, 1994).

Na literatura nenhum caso foi descrito com intoxicação alimentar pelo Clostridium absonum. Embora esse microrganismo possa estar presente no intestino humano, no solo e em alimentos seria fundamental a realização de uma avaliação mais criteriosa sobre o assunto.

5.2. Xilanases

A endo-1,4-ß-xilanase comumente chamada de xilanase possui grande aplicação em diferentes tipos de indústrias tais como a de ração animal, alimentos, têxteis, de papel e celulose, de produção de etanol a partir de biomassa e de produtos farmacêuticos. Isso se deve ao fato de que esta enzima atua na hidrólise da xilana, o segundo mais abundante polissacarídeo encontrado na natureza, que está presente ligado à hemicelulose da parede celular de plantas. Pode ser obtida, com a utilização de organismos, sobretudo culturas de fungos e cultura de algumas bactérias. (MOTTA, 2008).

O estudo refere-se à produção de xilanase termoestável livre de celulase a partir de amostra isolada e identificada de Clostridium absonum CRF-702 em um meio definido sob condições de cultivo anaeróbio, em alta temperatura (acima de 65 graus C). Condições diferentes de fermentação foram padronizadas para o crescimento e atividade xilanase. O ótimo de crescimento foi de 72-96 h em pH 8.5 e cultivo na temperatura de 75-80 graus C. (RANI & NAND,2000).

Esse trabalho foi citado por diversos autores na literatura em relação ao meio desenvolvido com produção de xilanase pelo Clostridium absonum.

Nas rações animais, as aves e suínos não possuem a capacidade de digerir as fibras e o uso de enzimas exógenas vem se destacando atualmente como uma oportunidade para incrementar o aproveitamento da energia presente nos   alimentos com consequente redução nos custos de formulações. O interesse tem aumentado devido ao custo cada vez maior das matérias-primas tradicionais e a busca por outros ingredientes alternativos como a cevada, aveia, arroz e trigo, entre outros. A enzima também é considerada como uma forma de reduzir a contaminação ambiental com nutrientes nos excretas, tais como o fósforo, nitrogênio, cobre, zinco, etc. Embora nem sempre se observem benefícios, a maioria das pesquisas de alimentação de poedeiras, frangos de corte e suínos indicam uma melhora na digestibilidade dos alimentos e no desempenho das aves e uma redução na quantidade de resíduos nos excretas. Uma melhora significativa na digestibilidade dos alimentos obtida com o uso de enzimas nas dietas permite alterações nas formulações das rações de forma a minimizar o custo, maximizando o uso dos ingredientes energéticos e proteicos das rações, possibilitando o uso de ingredientes alternativos regionais de menor custo, em substituição ao milho e ao farelo de soja. Para dietas de baixa viscosidade (milho, sorgo e soja) estão sendo pesquisadas enzimas para sua adição (amilase, protease, lípase e xilanases), visto que são os ingredientes mais utilizados nas condições brasileiras de produção animal e podem ter a digestibilidade melhorada. Soto-Salanova, 1996, cita que essas enzimas já estão no mercado com resultados iniciais promissores, sendo que a adição destas enzimas poderá se tornar uma prática rotineira e com boa relação benefício/custo, como é o caso com dietas baseadas em trigo e cevada. (CAMPESTRINI et al., 2005).

Os substratos hemicelulósicos de baixo custo, como sabugo de milho, talo de milho, farelo de trigo, palha de trigo, bagaço de cana, farelo ou palha de arroz têm sido adequados para a produção de xilanases no caso de certos microrganismos, tais como Clostridium absonum Rani & Nand, 2000. (LOPES, 2010).

Embora numerosas espécies produtoras de xilanase tenham sido descritas, a produção comercial é restrita. Entretanto, o cenário futuro pode ser diferente, devido às várias espécies promissoras relatadas e que produzem xilanase com alto rendimento e com maior estabilidade em condições extremas de pH e temperatura. (TECHAPUN et al., 2003).

A revisão de Harris&Ramalingam, 2010, realizada na Índia discutem algumas propriedades das xilanases e sua aplicação na indústria de alimentos. Foi mencionado como referência o trabalho de Rani & Nand, 2000, sobre o meio de produção de xilanase pelo Clostridium absonum pharmaceuticals. A aplicação econômica em diferentes tipos de indústria, seria, assim favorável com a produção de xilanases pelo Clostridium absonum e outros microrganismos utilizados em um meio definido.

6. BIOLOGIA MOLECULAR

6.1. Plasmídeos

Plasmídeos são moléculas circulares duplas de DNA capazes de se reproduzir independentemente do DNA cromossômico. Ocorrem geralmente em bactérias e por vezes também em organismos eucarióticos unicelulares e células de eucariotas superiores. O seu tamanho varia entre poucos milhares a mais de cem mil pares de bases. Existem entre uma, para grandes plasmídeos, até várias dezenas de cópias de um mesmo plasmídeo numa única célula. A replicação do DNA plasmídico é feita pela mesma maquinaria celular que realiza a replicação do DNA cromossômico, à mesma velocidade ou a uma velocidade superior (o que provoca um número elevado de cópias do plasmídeo na célula). Os plasmídeos replicam-se de forma independente do DNA cromossômico, mas a sua replicação dá-se a cada divisão celular de forma a conservar pelo menos uma cópia em cada célula-filha. (LODISH et al., 2000).

Um rápido procedimento de isolamento de plasmídeos de Clostridium perfringens e Clostridium absonum  foi descrito. O método pode ser ampliado, sem dificuldade, numa preparação em larga escala. O resultado no isolamento de plasmídeos pelo método rápido de eletroforese em 0,7% gel agarose (técnica em biologia molecular) -100V. A relação entre o volume de cultura e o volume do tampão de lise foi considerada crucial para o isolamento eficiente do plasmídeo. (amostra-tipo). O método pode ser ampliado, sem dificuldade, para preparação de plasmídeo em larga escala. Clostridium absonum (ATCC 27637) foram visíveis, recém descobertos e relatados aqui: 2(dois) plasmideos, de Clostridium absonum cerca de 3.5 e 4.0 kb  foram  detectados por   eletroforese  (ROBERTS et al., 1988).

Relatos de trabalhos sobre enterotoxina com a participação dos plasmídeos, em casos de intoxicação alimentar pelo Clostridium perfringens tipo A serão citados:

-O gene de enterotoxina (cpe) de Clostridium perfringens tipo A poderia ser cromossômico ou transmitido por plasmídeos. (CORNILOTT et al., 1995)

-Clostridium perfringens tipo A isolado em intoxicação alimentar teria um gene-enterotoxina (cpe) cromossomial, enquanto Clostridium perfringens tipo A isolado e responsável por doença gastrointestinal humana não origem alimentar carregaria um plasmídeo gene-cpe. (MYAMOTO et al., 2002).

-A prevalência de vários genótipos de Clostridium perfringens tipo A carregando gene-enterotoxina (cpe-positivo) seria conhecido e segundo os autores o plasmideo-cpe uma causa comum na intoxicação alimentar. (LAHTI et al., 2008). 

Discussão de relevância analisar no futuro, no campo da biologia molecular, se o plasmídeo de Clostridium absonum poderia carregar gene-enterotoxina, já que apresenta semelhança com Clostridium perfringens tipo A, além de outras características importantes. Entretanto nada foi encontrado na literatura sobre a produção de enterotoxina pelo Clostridium absonum, apesar de formar esporos no processo de esporulação e estar presente no intestino humano e de animais.

7. ENGENHARIA GENÉTICA

7.1. Coenzima 7α e 7β- hidroxiesteróide desidrogenase-HSDH

As coenzimas são pequenos cofactores de estrutura molecular orgânica que se caracterizam por se ligarem fracas e não permanentemente às enzimas (em oposição aos agentes prostéticos), sendo libertadas após a catálise. Normalmente estão associadas à transferência de grupos químicos (electrons e hidrogênios) entre enzimas. As vitaminas são componentes usuais das coenzimas. O NAD⁺, NADP⁺, ATP e coenzima A, intermediários do metabolismo celular, são exemplos de coenzimas. (DOURADO, 2011).

Na literatura as pesquisas relacionadas à coenzima 7α e 7β- hidroxiesteróide desidrogenase-HSDH de Clostridium absonum foram mencionadas em trabalhos recentes como destaque no âmbito científico, principalmente na China e enumeradas:

- Clonagem, expressão recombinante e caracterização funcional de 7 α e 7 β-hidroxiesteróide desidrogenase de Clostridium absonum foram recentemente relatados. A 7α-hidroxiesteróide desidrogenase (7α-HSDH) dependente de fosfato de nicotinamida adenina fosfato e 7β-hidroxiesteróide desidrogenase (7β-HSDH) de Clostridium absonum catalisa a epimerização de ácidos biliares primários através de intermediários ácido 7-ceto biliar e pode ser adequado como biocatalisador para o síntese de derivados de ácidos biliares de interesse farmacológico. (FERRANDII et al., 2012). 

-Carboxil-terminal e Arg38 são essenciais para a atividade da 7α-hidroxiesteróide   desidrogenase   de Clostridium absonum. A 7a-hidroxiesteróide desidrogenase (7a-HSDH, EC 1.1.1.159), uma das superfamílias desidrogenase / redutase de cadeia curta, catalisa a desidrogenação do grupo hidroxila em C7 do esqueleto esteróide dos ácidos biliares.. Clostridium absonum 7α-HSDH (Ca7α-HSDH) foi clonado e expresso heterologamente em Escherichia coli. O estudo confirmou que C-terminal e Arg38 eram essenciais para a função catalítica de Ca7α-HSDH e a atividade enzimática pode ser melhorada por íons metálicos (DESHUAI et al., 2014).

-A estrutura 7α hidroxiesteróide desidrogenase de Clostridium absonum em 3-Dimensão: novos insights para as argininas - NADP (H). A estrutura de 7α-HSDH de Clostridium absonum (Ca.7α-HSDH) com ácido tauroquenodesoxicólico (TCDCA) e NADP + foi evidenciada por cristalografia- difração de raios X. (DESHUAI et al., 2016).

-Contribuição funcional dos sítios determinantes de especificidade da coenzima 7α- hidroxiesteróide desidrogenase de Clostridium absonum. Os estudos dos determinantes moleculares da especificidade da coenzima ajudaram revelar a relação estrutura-função das enzimas, especialmente no que diz respeito aos sítios determinantes da especificidade da coenzima que geralmente medeiam interações complexas. (LOU et al., 2017).

-Engenharia de 7β-hidroxiesteróide desidrogenase para a produção de ácido ursodesoxicólico (UDCA). O ácido ursodesoxicólico (UDCA) é o principal componente ativo da bile natural de urso com múltiplas funções farmacológicas. A 7β-hidroxiesteróide desidrogenase (HSDH) é um dos principais biocatalizadores para a síntese do UDCA. No entanto, todas as 7β-HSDHs relatadas comumente sofrem de baixa atividade e estabilidade térmica, resultando em produtividade limitada do UDCA. O estudo resultou em melhorar a atividade, termoestabilidade e pH ótimo de uma 7β-HSDH.  Portanto, a eficiência catalítica de uma enzima chave, que facilitou significativamente a bioprodução do UDCA. (ZHENG et al., 2017).

-Ácido taurodesoxicólico (TUDCA) tem sido empregado para tratamento de muitas doenças hepato biliares. Efetivamente 7α-hidroxiesteróide desidrogenase (7α-HSDH) e 7β-hidroxiesteróide desidrogenase (7β-HSDH) são 2 (duas) enzimas chaves que direcionam a eficiente biossíntese de TUDCA a partir do ácido tauroquenodesoxicólico (TCDCA) in vitro. No estudo, a abordagem metagenômica foi utilizada para isolar 7α- e 7β-HSDHs de amostras fecais de urso preto. Cinco (5) novas 7α-HSDHs e uma (1) nova 7β-HSDH foram descobertas e identificadas na microbiota intestinal de urso preto e quatro (4) delas apresentaram boa propriedade enzimática. Codificação dos genes 7α-HSDHs tem sido clonado de Eubacterium sp., Escherichia coli, Clostridium sordellii, Bacteroídes fragilis e Clostridium absonum. Em contraste, menos informação disponível para 7β-HSDHs. Entretanto, a codificação de 4 (quatro) genes 7β-HSDHs tem sido clonado de Clostridium absonum, Collinsella aerofaciens, Ruminococcus gnavus e Ruminococcus. torques. Assim, seria necessário encontrar melhores 7α-HSDHs e 7β-HSDHs para a biossíntese eficiente de TUDCA (CAN  et al., 2017).

-Engenharia de 7α-hidroxiesteróide desidrogenase de Clostridium absonum para melhorar a termoestabilidade O aumento da termoestabilidade das 7α-hidroxiesteróides desidrogenases (7α-HSDHs) é benéfico para a sua aplicação industrial em geral. O principal objetivo desse estudo foi verificar os efeitos das mutações (7(sete) mutações de Clostridium absonum (Ca7α-HSDH) foram selecionadas e verificadas experimentalmente), em hélices selecionados a partir dos resultados preditivos na melhoria da estabilidade térmica da Ca 7α-HSDH. (LOU et al., 2018).

-Atividade desenvolvida e tolerância ao substrato de ácido cetolitocólico-7(7-KLCA). 7-KLCA é um importante intermediário para a síntese de ácido ursodesoxicólico (UDCA). UDCA é o principal componente eficaz do pó de bile de urso que é usado na medicina tradicional chinesa para o tratamento de cálculos biliares de colesterol humano. 7α-hidroxiesteróide desidrogenase (7α-HSDH) é a enzima chave usada na produção industrial de 7-KLCA.  Infelizmente, as 7α-HSDHs naturais relatadas têm dificuldade para cumprir os requisitos de aplicação industrial, devido as suas pobres atividades e forte inibição do substrato. Nesse estudo, aplicou-se uma estratégia para melhorar a eficiência catalítica e tolerância das concentrações altas do substrato de NADP +- 7α- HSDH dependente de Clostridium absonum. (HUANG et al., 2019).

As pesquisas no campo da engenharia genética atualmente relacionadas e as desidrogenases de Clostridium absonum mostraram o interesse dos pesquisadores em estudar esse anaeróbio obrigatório que apresentou uma grande variedade em suas aplicações. A última publicação encontrada foi sobre ácido cetolitocólico-7(7-KLCA) Huang et al., 2019. (Hunan Flag Bio-tech Co., Ltd., Changsha, 410100, China. (binhuang1984@163.com.) / College of Life Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha, 410004, China.).

As publicações anteriores citadas foram Lou et al., 2018. (Postdoctoral Research Station of Biology, Chongqing University, Chongqing 400030, China; Key Laboratory of Biorheological Science and Technology (Chongqing University), Ministry of Education, College of Bioengineering, Chongqing University, Chongqing 400030, China.). Zheng et al., 2017. (State Key Laboratory of Bioreactor Engineering and Shanghai Collaborative Innovation Center for Biomanufacturing Technology, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, P. R. China.). Can et al., 2017. (¹Key Laboratory of Biorheological Science and Technology (Chongqing University), Ministry of Education, College of Bioengineering, Chongqing University, Chongqing 400030, China

²Chongqing Key Laboratory of Medicinal Resources in the Three Gorges Reservoir Region, School of Biological & Chemical engineering, Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China.

^aEmail: moc.621@0002cbgnaw

^bEmail: moc.621@liamnujnat )

As linhas de pesquisas sobre Clostridium absonum tornaram-se muito abrangentes e diversificadas e o objetivo foi mostrar através das publicações enumeradas o panorama mundial dos trabalhos publicados sobre essa nova bactéria anaeróbia, com características muito semelhantes ao Clostridium perfringens   com numerosas referências bibliográficas.

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS

A revisão de trabalhos na literatura mostrou que Clostridium absonum, bactéria anaeróbia obrigatória, no grupo dos clostrídios sacarolíticos, e com característica de formar esporos, apresenta semelhanças em suas características com Clostridium perfringens. Essa bactéria foi pioneiramente estudada no Japão a partir de amostras não identificadas e posteriormente isolada no Brasil. As pesquisas realizadas enfatizaram a importância com Clostridium perfringens em suas propriedades culturais, bioquímicas, morfológicas e genéticas.

A fosfolipase C (alpha toxina) produzida pelo Clostridium absonum seria semelhante à alpha toxina de Clostridium perfringens tipo A apresentando atividade lecitinase, hemolisina e toxina letal e exibindo baixa avidez pelas antitoxinas de Clostridium perfringens tipo A. Modelos experimentais em 3D por cristalografia-difração de raio X mostraram diferenças entre à alpha toxina de Clostridium absonum e de Clostridium perfringens tipo A.

Clostridium absonum poderia ser isolado a partir de material clínico, solo, alimentos e fezes e, segundo pesquisa realizada no Brasil, foi identificado apenas pelas provas de fermentação de lactose (+), salicina (+), rafinose (-), hidrólise do amido (-), associados à sua morfologia colonial e celular. Foram comparados 2 (dois) métodos de isolamento a partir de amostras de solo, empregando-se duas (2) técnicas: a técnica A, baseou-se na produção de lecitinase pela bactéria, enquanto a técnica B utilizou-se da propriedade da não neutralização da toxina de Clostridium absonum usando-se 2 (duas) unidades internacionais (2UI) de antitoxina de Clostridium perfringens tipo A. Foi empregado o meio agar gema de ovo-lactose-vermelho neutro, sendo que a técnica B mostrou melhor resultado.

Clostridium absonum e Clostridium sardiniense foram considerados semelhantes em suas propriedades biológicas e bioquímicas, entretanto sua posição taxonômica não foi clara pela hibridização de DNA-DNA. Clostridium absonum formou alta identidade com Clostridium sardiniense, implicando que são sinônimos heterotípicos.

Por apresentar semelhanças ao Clostridium perfringens, muitas identificações errôneas poderiam ter sido feitas pelos poucos trabalhos encontrados na literatura. O interesse em estudá-lo se tornou progressivo, no qual foi dado destaque relevante em casos de gangrena gasosa, na produção de ácido ursodesoxicólico associado à dissolução de cálculos biliares, na produção de xilanase com aplicação nas indústrias de alimentos e no isolamento de plasmídeos com estudos futuros na biologia molecular. Os trabalhos mais recentes revelaram o interesse sobre a coenzima hidroxiesteróide desidrogenase (HSDH) na qual foram discutidos e apresentados relatos no campo da engenharia genética.

Gangrena gasosa

Nos resumos bibliográficos a produção de fosfolipase C (alpha toxina) pelo Clostridium absonum poderia estar relacionada à patogênese da doença e suas propriedades seriam compatíveis no seu papel como um determinante de virulência na gangrena gasosa. Foi demonstrada a presença de toxina letal no filtrado da cultura, embora poucos casos tenham sido descritos como causados por Clostridium absonum e no relato de um deles foi concluído o bom prognóstico pela baixa patogenicidade desse microrganismo. A identificação do Clostridium absonum dos casos apresentados foi determinada predominantemente pela incompleta neutralização da reação de lecitinase pelas antitoxinas de Clostridium perfringens tipo A em meio de Nagler, além das propriedades culturais, morfológicas e bioquímicas.

Cálculos biliares

Clostridium absonum, presente no intestino humano dando origem ao ácido ursodesoxicólico (UDCA) a partir de ácidos biliares primários. Tendo sido definido o interesse deste ácido em terapêutica nos pacientes com cálculos biliares de colesterol, por ser primordial para a dissolução apresentando tamanho pequeno com diâmetro máximo de 1,5 cm.

Clostridium absonum sintetiza 7α e 7β hidroxiesteróide desidrogenase (HSDH) e uma série de outras proteínas em resposta aos ácidos biliares que podem ser tóxicos na ausência das desidrogenases. A HSDH catalisa a epimerização de ácido quenodesoxicólico (CDCA) ao ácido ursodesoxicólico (UDCA) que é menos tóxico. O UDCA de Clostridium absonum pode ser obtido a partir de culturas num meio definido.

A caracterização funcional de 7α e 7β hidroxiesteróide desidrogenase produzida pelo Clostridium absonum permitiu a detecção de ácido ursodesoxicólico (UDCA) na urina e no soro de pacientes em tratamento por um método fluorimétrico enzimático.

O aumento de ácido ursodesoxicólico através da administração de bactérias vivas de Clostridium absonum no método experimental em suínos pode levar a atividade probiótica futura em humanos desde que possa ser expressa por um microrganismo alimentar seguro.

Muitos trabalhos foram citados e analisados nos quais demonstraram o uso terapêutico sobre dissolução de cálculos biliares com ácido quenodesoxicólico (CDCA) e ácido ursodesóxicolico (UDCA). Uma pesquisa realizada concluiu que em pacientes com microcálculos e vesícula permeável puderam ter os cálculos dissolvidos.

Alimentos:

1- Intoxicação alimentar

A presença de Clostridium perfringens tipo A principalmente em alimentos refrigerados inadequadamente à base de carne bovina e de frango é muito grande como foi discutido. Bactérias vivas resultantes da germinação dos esporos, que são termorresistentes podem produzir uma toxina (enterotoxina) no interior do intestino que causa a infecção alimentar toxigênica. Foram isoladas amostras termorresistentes (aquecidas 80 graus C/10 min e 100 graus C/60 min) e amostras enterotoxigênicas em carne moída bovina de açougues da cidade do Rio de Janeiro e identificadas pela técnica de imunodifusão radial dupla. A resistência dos esporos de Clostridium absonum a altas temperaturas (70 graus C,10 min), sua semelhança com o Clostridium perfringens e pelo fato de ter sido isolado a partir de alimentos, fezes e do solo, levou a elucidar o problema de intoxicação alimentar, entretanto precisaria ser analisado com maior profundidade, já que não foram encontrados relatos de casos na literatura.

2- Xilanases

A produção de xilanases pelo Clostridium absonum num meio definido podendo ser aplicada economicamente em diferentes tipos de indústria em destaque a de rações animais. Atualmente como uma oportunidade para incrementar o aproveitamento da energia presente nos alimentos com consequente redução nos custos das formulações. Um estudo foi realizado na Índia sobre algumas propriedades das xilanases e suas aplicações na indústria de alimentos. Clostridium absonum foi citado como referência com relação ao meio desenvolvido pela produção de xilanase.

Biologia molecular

No campo da biologia molecular foram isolados os plasmídeos do Clostridium absonum e de Clostridium perfringens através de um método simplificado, utilizando a eletroforese em gel agarose podendo resultar em novas pesquisas, inclusive na investigação de gene-enterotoxina em seu plasmídeo. Os estudos precisariam ser realizados com maiores esclarecimentos e aprofundamento já que o gene-enterotoxina de Clostridium perfringens tipo A poderia ser cromossomial ou transmitido por plasmídeo, servindo, assim, como referência.

Engenharia genética

Modelos experimentais foram apresentados em 3-Dimensão por cristalografia- método de difração de raio X da estrutura alpha toxina (fosfolipase C) de Clostridium absonum e da enterotoxina e alpha toxina de Clostridium perfringens tipo A através das pesquisas na engenharia genética.

As publicações encontradas nos últimos anos sobre Clostridium absonum revelam um avanço sobre a coenzima hidroxiesteróide desidrogenase de Clostridium absonum (CaHSDH), sendo os trabalhos realizados principalmente na China onde foram selecionados.

- Clostridium absonum 7α-HSDH sendo clonado e expresso heterologamente em Escherichia coli.

- Efeitos de mutações de Clostridium absonum para melhoria da estabilidade térmica de CA7α-HSDH.

- 3D estrutura de 7α-HSDH de Clostridium absonum com ácido tauroquenodesoxicólico (TCDCA) e NADP + por cristalografia - difração de raio X.

- Melhoria da atividade, termoestabilidade e pH ótimo da 7β-HSDH, eficiência catalítica de uma coenzima chave, que facilitou significamente a bioprodução do UDCA.

- Pesquisas com ácido taurodesoxicólico(TUDCA) têm sido realizadas para o tratamento de muitas doenças hepatobiliares, melhorando os efeitos da  terapia na doença de Alzheimer, doença de Parkinson e prevenindo as doenças relacionadas à apoptose.  Efetivamente 7α-HSDH e 7β-HSDH são coenzimas que direcionam a biossíntese de TUDCA a partir do TCDCA in vitro.

- Codificação dos genes 7α-HSDHs clonado de Clostridium absonum (ATCC 27555) e outros microrganismos. A 7β-HSDHs foram clonadas com menos informação disponível de Clostridium absonum (ATCC 27555) e outros microrganismos. São alguns relatos importantes sobre os estudos mencionados.

Foram encontrados trabalhos na literatura sobre Clostridium absonum no Brasil, Japão, Canadá, EUA, França, Reino Unido, Itália, Índia e China mostrando o interesse mundial com   ampla  pesquisa .

9. CONCLUSÃO

A importância desse trabalho não só seria com relação a uma nova bactéria anaeróbia apresentada, mas sobretudo como discutido, destaque sobre a gangrena gasosa, no problema de dissolução de cálculos biliares, em alimentos com a produção de xilanase e no isolamento de plasmídeos. Uma visão no futuro com os trabalhos já desenvolvidos sobre a coenzima hidroxiesteróide desidrogenase do Clostridium absonum (Ca HSDH) no sentido de aplicação principalmente em terapêutica do trato biliar.

A bagagem de trabalhos publicados é muito extensa, aparecendo na literatura com um número diversificado como foi apresentado sendo que o objetivo foi alcançado com relação ao Clostridium absonum. Quando estudado o assunto numa tese de mestrado pelo autor no Brasil, isolado e identificado a partir de amostras de solo, somente poucas referências foram encontradas no âmbito científico. Tendo em vista a ampliação da bibliografia, levou-nos a apresentar e selecionar dados e considerações importantes no cenário mundial nas aplicações desse microrganismo, onde as linhas de pesquisas sobre Clostridium absonum tornaram-se abrangentes e importantes.

Agradecimentos

Aos meus queridos pais in memoriam e ao Dr Gobert Araujo Costa pela orientação científica in memoriam.

10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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5- CAMPESTRINI, E.; SILVA, VTM.; APPELT, MD. Utilização de enzimas na alimentação animal. Revista Eletrônica Nutritime 2005; 2 (6): 259-272.

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8-CORNILLOT, E.; SAINT-JOANIS, B.; DAUBE, G.; KATAYAMA, S.; GRANUM, PE.; CANARD, B.; COLE, ST The enterotoxin gene {cpe}of Clostridium perfringens can be chromosomal or plasmid-borne. Mol Microbiol. 1995; 15: 639 - 647.

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