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Extração e Purificação de Plasmideos

Biologia

Extração e Purificação de Plasmideos, Lise alcalina, Resultados de discussão, Conjução bacteriana, Material e métodos, Discussão, Método de Boiling, Maxi Prep.

Lise alcalina

Introdução

Os plasmídeos em procariotos, ou epissomos em eucariotos, são moléculas de DNA circular com capacidade de replicação independente e estável, mantendo seu número constante através de várias gerações, no estado não integrado ao cromossomo do hospedeiro. Os plasmídeos estringentes ocorrem em pequeno número de cópias por células, enquanto os relaxados em grande número de cópias por célula.

Apesar de não serem indispensáveis à vida das células, em determinadas situações os plasmídeos podem conferir-lhes propriedades essenciais à sobrevivência. Eles são responsáveis por inúmeros casos de resistência múltipla a drogas em bactérias e pela estabilidade de importantes microorganismos utilizados na indústria. Genes plasmidiais controlam a codificação de importantes enzimas envolvidas em diferentes etapas da industrialização do leite e do vinho.

Os plasmídeos são dependentes da DNA-polimerase ( que duplica o DNA ), da RNA-polimerase (que copia as informações contidas no DNA ) e da maquinaria de tradução ( síntese de proteínas ) da célula hospedeira . Devido a sua habilidade de replicação independente e recombinação gênica os plasmídeos são amplamente utilizados em estudos de engenharia genética e biologia molecular como vetores de genes e/ou fragmentos de DNA dos quais se queira saber as sequências de bases ou as sequências de aminoácidos.

Ao ser inserido no plasmídeo o fragmento passa também se replicar seguindo as divisões celulares e com isso aumentando exponencialmente seu número, fornecendo material suficente para expressão, sequenciamento e manipulação gênica do frgmento.

As técnicas de DNA recombinante permitem a construção de plasmídeos artificiais, nos quais sabe-se exatamente onde se liga o fragmento de interesse. Esses plasmídeos artificiais são usados, por exemplo, para a produção de insulina em bactérias.

Por todas estas vantagem a utilização de plasmídeos é de grande interesse. Entretanto para seu uso estes devem ser isolados das células hospedeiras. Neste sentido várias técnicas específicas para extração e purificação DNAs plasmidiais foram desenvolvidas.

Durante as aulas práticas foi realizada a extração de plasmídeos de bactérias ( previamente incubadas para seu crescimento e, consequentemente, aumento do número de plasmídeos ) através do método de Lise Alcalina, utilizando para tanto o Kit Promega “Wizard Minipreps DNA Purification System” seguindo o protocolo descrito abaixo:

Centrifugar a cultura de células em tubos eppendorf de 1,5mL por quatro minutos a 13000 rpm (rotações por minuto ).

Retirar o sobrenadante de modo que apenas a massa de células fique no tubo.

Ressuspender em 150L do meio 1 e aguardar 5min. O EDTA possui ação quelante aprisionando os íons Ca2+ e Mg2+ o que desestabiliza a membrana celular e promove o inchamento da célula pela entrada de glicose, o Tris funciona como um tampão, Rnase A degrada todo o RNA, impedindo que este possa prejudicar a extração.

Adicionar 150L de solução 2 de lise e homogeneizar por 5min. O SDS é um detergente aniônico que promove uma ruptura das ligações covalentes da membrana e uma retirada de lípides havendo a formação de pequenos poros que permitem a passagem dos plasmídeos para fora da célula sem que saia o DNA cromossomal, o NaOH aumenta o pH o que desestrutura a membrana auxiliando na formação dos poros.

Adicionar 150L de solução de neutralização e homogeneizar por 4 min. O Acetato de Potássio irá retirar as proteínas que envolvem o plasmídeo e voltará com o pH para próximo de 8, impedindo que a solução dois quebre as ligações covalentes do plasmídeo.

Centrifugar e retirar o sobrenadante. Os vestígios de célula ficarão retidos no “pellet”.

Adicionar 10L de resina e homogeneizar por dez minutos. Durante a homogeneização o sobrenadante se difunde pela resina.

Transportar a mistura para uma coluna aclopada à bomba de vácuo. Com a aplicação do vácuo o DNA se precipita na resina ficando retido nesta.

Adicionar 2,5mL de etanol 80% na coluna. Retiramos assim o resto das soluções.

Centrifugar por 20 seg a 14000 rpm. Durante o spin todo o líquido é extraído da coluna.

Transporta a coluna para um novo eppendorf e adicionar 50L de ddH2O a 70ºC. Com isso o DNA é resolubilizado.

Centrifugar por 4 min a 13000 rpm. O DNA resolubilizado pode então passar pela resina e ficar retido no eppendorf.

Posteriormente o produto da purificação foi corrido em gel de agarose 1% para a verificação do rendimento do protocolo. O gel foi feito utilizando-se 40mL de tampão TAE 0,5x e 0,4g de agarose. Os dois compostos são misturados em um Elenmeyer e posteriormente aquecidos para que haja uma homogeneização mais eficiente. Depois de resfriada é adicionado 0,5µL de brometo de etídeo ( este composto se intercala entre as fitas de DNA e durante a emissão de luz ultravioleta este fluoresce indicando a posição da amostra no gel ) e a solução é transportada para uma cama onde o gel se polimeriza.

Para a corrida 2µL da amostra junto a 5µL de tampão 1× são aplicados na canaleta ( o tampão da amostra é mais denso do que aquele utilizado na corrida, isso impede que a amostra se dilua e saia da canaleta ). Em uma outra canaleta é aplicado um “pool” de DNA ( marcador de peso molecular ) que indicará o tamanho aproximado dos fragmentos da amostra, uma vez que o tamanho dos fragmentos deste pool já são conhecidos. O tamanho das bandas da amostra pode ser comparado com as bandas do “pool” já que o gel forma uma malha que faz os fragmentos migrar de acordo com o tamanho e com a conformação, fig 01. Fragmentos menores ou mais compactados migram com maior facilidade do que fragmentos maiores ou menos compactados. Para que o DNA migre é aplicada uma corrente elétrica, ele migrará para o polo positivo, já que é carregado negativamente ( graças ao grupo fosfato ). A eletroforese é feita a 100volts e aproximadamente 40 miliamperes, durante 20 min.

Resultados e discussão

Após a irradiação do gel com luz ultravioleta pode-se visualizar três bandas distintas. A banda que correu de forma mais lenta Mais próxima à canaleta ) correspondendo ao plasmídeo linearizado, a do meio ao plasmídeo circular relaxado e a banda que correu mais rapidamente ( mais distante da canaleta ) correspondendo ao plasmídeo super-espiralado ou “super-coiled”, pois este passa com maior facilidade entre as malhas do gel, fig 01.

Comparando a distância percorrida pela amostra com o DNA padrão, pode-se estimar o número de pares de base da amostra. A intensidade da banda comparada com a de um outro DNA previamente quantificado pode indicar a quantidade de material obtido na extração.

Analisando os resultados obtidos pôde-se observar que a quantidade e o tipo de material obtidos foram satisfatórios, indicando sucesso dos procedimentos realizados.

Conjugação bacteriana

Introdução

As alterações genéticas podem ser resultados de vários processos, os quais são conhecidos como mutação, recombinação, transposição e rearranjos cromossômicos.

A mutação pode ser definida como um evento que dá origem a alterações quantitativas ou qualitativas no material genético. Uma vez que o DNA é uma molécula relativamente estável as mutações são fenômenos raros. As mutações bacterianas espontâneas incidem em taxas de 10-6 a 10-10 por geração por nucleotídeo, por isso as mutações são induzidas em laboratório para serem estudadas.

Existem três processos de troca de material gênico ( não necessariamente relacionados com reprodução ) conhecidos em bactérias: transformação, transdução e conjugação.

A transformação foi estudada primeiramente por Griffith, em 1928, quando inoculou em uma população de camundongos uma mistura de pseudococos vivos e lisos, e em outra pseudococos mortos porém encapsulados. O resultado obtido foi que em ambas as inoculações não houve morte dos camundongos, entretanto quando se inoculava na mesma população pseudococos vivos e lisos e pseudococos mortos encapsulados, havia uma alta taxa de mortalidade.

Era sabido que estas bactérias quando vivas e encapsuladas são letais ao serem inoculadas em camundongos, com isso pôde-se inferir, mais tarde, que as bactérias vivas lisas capturavam o DNA das bactérias mortas o inseria em seu genoma e adquiriam a capacidade de produzir cápsula se tornando patogênicas. A este fenômeno de inserção de material genético, ao genoma pré existente, denominou-se transformação ( as bactérias não patogênicas foram transformadas em patogênicas ). Embora Griffith não conhecesse o DNA seus estudos foram e ainda são de grande relevância.

A transdução foi descrita por Zinder e Lederberg, em 1952, ao estudarem conjugação entre espécies de Salmonella. Utilizando bactérias resistentes, bactérias não resistentes a determinadas drogas, bacteriofagos, e observando a aquisição de resistência pelas bactérias não resistentes, eles observaram que fagos podem incorporar parte do genoma de uma bactéria hospedeira e transportá-lo para outra e desta forma capacitar as mesmas a resistirem a determinadas alterações e composições do meio.

A conjugação bacteriana foi observada por Lederberg e Tatum, em 1946. Combinando duas amostras auxotróficas de Escherichia coli e encubando as duas juntas verificaram que, algumas colônias haviam adquirido a capacidade de se desenvolver em meio mínimo. Concluíram que teria havido uma complementação ou aquisição de algum elemento que tornava as bactérias antes auxotróficas em prototróficas. Este elemento foi denominado Fator F.

Hoje se sabe que o Fator F é um plasmídeo conjugativo e que somente células F+ podem atuar como doadoras para células receptoras ou F-, desta forma o processo de conjugação depende do Fator F, também denominado epissoma. Os epissomas são peças de DNA ligadas à membrana citoplasmática, podem replicar de forma autônoma ou integrar ao DNA cromossomal replicando com ele.

A célula doadora forma uma ponte protéica denominada Pili, a qual se liga na célula receptora estabelecendo contato citoplasmático entre as duas células. Há uma ruptura do plasmídeo conjugativo que se lineariza e inicia sua duplicação permitindo que o novo plasmídeo formado possa ser transportado através do Pili para a célula receptora.

Material e métodos

Foram utilizadas duas linhagens de E. coli, previamente incubadas em caldo nutriente a 37ºC por 24 horas, as quais eram resistentes a antibióticos diferentes:

BH100 ( Lac+, resistente à ampicilina, canamicina, mercúrio , clorofenol e tetraciclina )

K12 ( Lac-, resistente à estreptomicina )

Ambas as cepas foram submetidas individualmente aos mesmos tratamentos descritos abaixo ( para o repique foi utilizado um bastão de platina ):

Ágar EMB ( controle positivo )

Ágar EMB- solução estoque de estreptomicina 200ng/mL

Ágar EMB- solução estoque de tetraciclina 20ng/mL

Ágar EMB- solução estoque de estreptomicina 200ng/mL, solução estoque de tetraciclina 20ng/mL

De uma cultura de 0,2mL de BH100 com 0,8mL de K12, inoculadas em 2mL de caldo nutriente incubadas a 37ºC por 24 horas, foi retirada uma alíquota de 0,1mL. A alíquota foi então semeada, com o auxilio de um bastão de vidro, em uma placa de Ágar EMB - solução estoque de estreptomicina 200ng/mL, solução estoque de tetraciclina 20ng/mL e incubada junto às demais a 37ºC por 24 horas.

Discussão

EMB é um meio rico, ou seja, contém todos os nutrientes necessários para o crescimento das colônias bacterianas, servindo assim como controle positivo. A cor verde brilhante apresentada pelas colônias de E. coli BH100 indica que estas bactérias utilizam a lactose como fonte de carbono, ou seja, são Lac+ ao contrário da linhagem K12 que se mostraram transparentes, Lac-.

O fato da linhagem BH100 não crescer em meio com estreptomicina indica que estas bactérias não são resistentes a este antibiótico, entretanto, seu crescimento em meio com tetraciclina indica resistência ao mesmo.

A linhagem K12 não foi capaz de crescer em meio com tetraciclina crescendo, entretanto, em meio com estreptomicina indicando uma resistência a este último antibiótico.

Na placa onde as linhagens foram semeadas juntas, as colônias apresentaram o aspecto da linhagem K12, transparentes. O fato destas bactérias terem crescido em meio com tetraciclina indica que elas adquiriram a capacidade de resistência a este antibiótico. Esta capacidade pode ter sido adquirida através de conjugação entre as duas linhagens de modo que K12 foi a linhagem receptora, uma vez que passou a apresentar uma nova característica, e BH100 a doadora, já que esta possuía a característica adquirida pela outra linhagem.

Através destes experimentos relativamente simples pode-se observar o fenômeno da conjugação em bactérias, ou seja a aquisição de material genômico, que foi evidenciada pela aparição de uma nova característica, resistência a tetraciclina.

Método de Boiling

Tem como principal vantagem a rapidez com que o DNA é obtido, porém a quantidade extraída é pouca, sendo a rentabilidade pior do que a lise alcalina. É usado para a lise, das paredes bacterianas, um detergente não-iônico lisozima e calor. Os vestígios de membrana e o DNA cromossomal se precipitam no fundo do tubo. Para a precipitação do plasmideo presente no sobrenadante utiliza-se isopropanol.

O protocolo do método está descrito abaixo:

Inocular 5mL de meio LB esterilizado com uma única colônia bacteriana. Incubar a 37ºC “over nigth”.

Transferir 1,5mL de cultura saturada para um tubo eppendorf, centrifugar por 2min. As células irão se depositar no fundo do tubo. Descartar o sobrenadante. Concentração das células.

Ressuspender as células em 300µL de solução STET contendo 200µg de lisozima. Agitar no vortex até a homogeneização completa. A lisozima irá desestruturar a membrana celular, por isso quanto mais expostas as células maior é a eficiência do processo.

Transferir o tubo par o gelo por 10min e depois em água fervente por 2min. O detergente e o choque térmico lisam a parede bacteriana permitindo a liberação dos plasmídeos mas não o cromossomo bacteriano que permanece ligado as células bacterianas.

Centrifugar por 20 min. O sedimento contém restos bacterianos e o DNA cromossomico, o sobrenadante contém os plasmídeos e RNA.

Transfirir o sobrenadante para um novo tubo sem transportar o sedimento. Misture o sobrenadante com 200µL de isopropanol gelado. Incubar a -20ºC por 15 a 30 min. Centrifugar por 15min. O isopropanol gelado precipita DNA e RNA.

Retirar o sobrenadante. Deixar o sedimento secar por alguns minutos.

Ressuspender o sedimento em 50µL de TE contendo 1µg/µL de Rnase. Degradação do RNA.

Usar 5µL para digestão com enzima de restrição. Liberação do inserto.

MAXI PREP

É um método utilizado para a extração de material gênico de grandes quantidades de amostra. O resulta é um material livre de contaminantes, porém requer o uso de Brometo de Etídio que é altamente carcinogênico e o uso de longas corridas em um aultra centrífuga para estabilizar o gradiente de densidade.

A massa de células bacterianas lisadas é misturada a ClCs ( promove o gradiente ) e EtBr sendo centrifugada até o equilíbrio. Esse gradiente é o principio básico da técnica, pois consegue isolar o DNA cromossomal do plasmídeo. O DNA cromossomal se liga ao agente intercalante ( Brometo de Etídio ) e diminui de densidade ficando na parte superior do gradiente enquanto o plasmídeo se mantém, por estar mais denso, na parte inferior do mesmo. Com o uso de uma seringa é possível coletar todo o plasmídeo extraído, fig 02. O EtBr é removido passando o plasmídeo em uma coluna de troca de cátions e o ClCs é removido por precipitação com o uso de etanol.

PEG
( Polietileno glicol )

PEG precipitação é um método rápido, adequado e conveniente para purificação de plasmídeo. Pode ser interrompido em qualquer passo sem que o DNA plasmidial seja afetado. Não há necessidade do uso de ultracentrífuga nem de Brometo de Etídio. RNA e DNA cromossomal são removidos do pellet por resuspensão com RNase, NaOH/SDS e acetato de potássio. O plasmídeo é extraído do sobrenadante e precipitado com PEG. É um método para a preparação de plasmídeos utilizados em procedimentos que necessitem de plasmídeos livres de qualquer contaminante.
 


Publicado por: Equipe Brasil Escola

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